SERIES GV-65 DE GRAVEDAD “NO VACÍO” PARA EL ANALISIS DE
6-MONOACETIL MORFINA EN ORINA POR GC/MS.
Este método es un procedimiento preliminar, solamente para uso en investigación,
aunque ha dado buenos resultados en nuestro laboratorio. El método tiene que
ser validado por nuestro laboratorio
antes de ser usado para reportar valores de pacientes. Apreciaremos sus
comentarios sobre su funcionamiento y serán bienvenidas las sugerencias para su
mejora y complemento.
Revisado:
Marzo 2002
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA- (Favor de leer las notas y la información
complementaria antes de continuar).
1.-Agregar 3.0
ml de orina a un tubo desechable de vidrio de borosilicato de 16x100 mm con un
tapón roscado inerte.
2.-Agregar 50
ng de 6-MAM-d3 para cada muestra (Ver la nota a).
3.-Opcional: (Ver
la nota a) pretratar las muestras adicionando de 1.0 ml de una solución
saturada de bisulfito de sodio (Ver la nota b). Preparar disolviendo 25 g de bisulfito
de sodio en 100 ml de una mezcla (1:1) de H20: 0.25M Buffer Fosfato, pH 6.0. Preparar
mensualmente. (Almacenar en refrigeración).
4. - Mezclar
cuidadosamente e incubar las muestras a 55°C por 15 min.
5. - Agregar 1.0
ml, 1% de HCl en agua desionizada.
6. - Si hay
turbiedad o precipitados centrifugar por 3 minutos a 3000 RPM.
Nota a:
El paso de reducción bisulfito de sodio, cuando se combina
con el paso de derivatización única elimina la interferencia de codones y morfones
sin afectar la morfina y la codeína o 6-MAM.Si esta interferencia no concierne,
este paso de reducción deberá ser eliminado y podrá continuar al paso 5
(arriba). La columna aún tiene que ser pretratada con bisulfito de sodio para
activar el intercambio medio en la resina.
INSTALACIÓN
DEL HARDWARE – Favor de consultar las instrucciones de instalación del Hardware
Detectabuse
ACONDICIONAMIENTO
DE LA COLUMNA
1. -Lavar la columna con 1.0 ml de
metanol. Llevar a flujo por gravedad.
2. -Agregar
1.0 ml de solución de bisulfito de sodio a cada columna. Llevar a flujo por gravedad.
Preparar disolviendo 25 g de bisulfito
de sodio en 100 ml de una mezcla (1:1) de H2O: 0.25M buffer Fosfato, pH 6.0.
Preparar Mensualmente.
3. - Proceder
a la extracción dentro de 60 min. del acondicionamiento de la columna.
EXTRACCIÓN DE A MUESTRA-(Favor de ver las notas al final de la sección antes de
proceder)
1.-Verter las
muestras dentro de la columna preacondicionada. Llevar a flujo por gravedad. Las
muestras fluirán a través de la columna a un flujo de 1-2 ml/min.
2. -Lavar la
columna con 3.0 ml de agua desionizada.
3.-Lavar la
columna con 2.0 ml de metanol. Llevar la columna a flujo por gravedad.
4.-Lavar la
columna con 1.0 ml de etil acetato. Llevar la columna a flujo por gravedad.
Proceder a la elución de la muestra.
Nota: Si
los líquidos no eluten libremente por flujo de gravedad, Probablemente haya
aire atrapado en el lecho de la columna. Golpeando ligeramente el plato montado
sobre la columna la caja de vacío iniciará el flujo.
ELUCIÓN DE LA MUESTRA
1. -La elución
de la muestra se hará fuera de la caja de vacío.
2. -Colocar la
columna montando el plato sobre el rack de elución cargado con el número
apropiado de tubos de prueba de vidrio borosilicato de 12x75mm ó 15x85 mm. Asegurarse
que el agujero patrón del plato ajuste con el agujero patrón del rack.
3. -Agregar
1.5 ml de n-Butil Cloruro:acetonitrilo (80:20) w/4% Trietilamina (TEA)* para
cada columna y llevar el solvente a flujo a través de la columna por gravedad
dentro de los tubos de prueba.
4. -Secar con
N2 ó Argón a menos de 50°C.
*La elución del solvente con 4% TEA, (4 ml de TEA se agregan
a 96 ml de una mezcla 80:20 de n-Butil Cloruro: Acetonitrilo) es estable por lo
menos un mes almacenado en un recipiente de vidrio con un tapón de teflón o
polipropileno lineal. Cerrar fuertemente cuando no se use.
Nota: Si
la muestra no elute libremente por flujo de gravedad, es probable que se encuentre
aire atrapado en el lecho de la columna. En la mayoría de los casos, golpeando
ligeramente la columna iniciará el flujo. Si no trabaja, usar una varilla de
hule para empujar cuidadosamente un par de gotas de solvente en elución y aire
atrapado dentro del tubo colector. Llevar el resto de solvente a flujo por
gravedad.
DERIVATIZACIÓN-
Usando TMSI/MBTFA
1.-Para cada
extracto seco agregar 70 uL de Acetonitrilo y 15 uL de Trimetilsililmidizol (TMSI).
2. -Mezclar el
contenido de los tubos, tapar e incubar a temperatura ambiente. Por al menos 5 minutos.
3.-Agregar 15
uL de N-Metil-bis (trifluoroacetamida) (MBTFA), mezclar el contenido de los tubos,
arrastrar con nitrógeno o argón, tapar el tubo o transferir el contenido dentro
de viales de reacción de 100 uL y sellar.
4. -Inyectar
1-2.0 uL
SUPLEMENTO- Cuando se use un sistema robótico automatizado.
Todos los líquidos
deberán llevarse a flujo sin ayuda a través de la columna o deberán ser
empujados a través de la columna con vacío o empujados a través de ella con
presión positiva. Los parámetros para flujo con ayuda deberán colocarse como
sigue:
Acondicionamiento de la columna- Pasar a través de la columna en
aproximadamente 20 segundos (+/- 20%).
La muestra, la
muestra lavada y el solvente en elución - Pasar a través de la columna en
aproximadamente 60 segundos (+/- 20 %).
GC/MS: Equipo Hewlett-Packard con detector selectivo de
masas.
Columna GC: H.P. Columna Capilar (o equivalente), 15 x 0.25, película 0.25
um de espesor.
Modo de adquisición: SIM
Detector temperatura de interfase: 295°C
Temperatura de
Programa:
Inicial:110°C programar
a 300°C a 25°C/min.
Tiempo de equilibrio:
1.0 min.
Separación:
Flujo de He: 1.0 ml/min.
a 200 °C
Purga: 2 ml/min.
Tiempo de salida de
purga: 1 min.
Solvente retraso: 5.0
min.
Arranque: 5.0 min.
Alto corrida: 9.0
min.
MSD PROGRAM
Componente Iones
Monitoreados Tiempo de retención
TMSI/MBTFA
6-Monoacetilmorfina 340,399,400 7.33
min.
6-Monoacetilmorfina-d3 290,343,402 7.32 min.
6-Monoacetilmorfina-d6 290,343,405 7.31 min.
Nota: El tiempo de retención y la gamma de iones variará algo de
instrumento a instrumento.